Infeksi cacing nematoda parasitik Ascaridia galli berlangsung di dalam usus halus unggas. Penelitian ini dilakukan untuk memurnikan dan menganalisa karakter protease dari ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli sebagai pemicu pertahanan mukosa berdasarkan proliferasi dan hiperplasia sel goblet, sel mast mukosa, sel eosinofil pada usus halus ayam petelur. Dosis 6000 L2 diberikan langsung ke dalam oesofagus 100 ekor ayam, dan tujuh hari kemudian larva yang sudah menetas (L3) diambil kembali dari dalam usus halus. L3 dikultur secara in vitro dalam medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), pH 6,8, tanpa merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37oC dan 5% CO2 selama 3 hari. Ekskretori/sekretori dipreparasi dari produk metabolisme L3 yang dilepaskan ke dalam medium kultur. Protease dimurnikan dengan ammunium sulfat, dialisis yang diikuti dengan kromatografi filtrasi gel matriks sephadex G-100. Matriks DEAE sephadex A-50 digunakan untuk pemurnian protease melalui kromatografi anion exchange. Aktivitas protease diuji pada kasein 2%. Aktivitas protease dikaji terhadap sensitivitas inhibitor, temperatur, dan pH. Konsentrasi protein dihitung mengikuti metode Bradford. Berat molekul protease diestimasi melalui sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE).

Oleh:
UMMU BALQIS
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007



HALAMAN PENGESAHAN
PRAKATA
RIWAYAT HIDUP

ABSTRAK

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Masalah kecacingan yang disebabkan oleh Ascaridia galli pada ayam petelur masih saja terjadi, akibatnya dapat menimbulkan kerugian ekonomi yang sangat berarti. Meskipun jarang menimbulkan kematian, namun ayam petelur mengalami penurunan produksi yang sangat signifikan karena sifat penyakit yang berjalan kronis (Kanwar et al. 1998). Cacing yang survive di dalam saluran cerna menjadi pengganggu pertumbuhan sehingga dapat menurunkan 30% bobot badan dan penurunan produksi telur yang mencapai 63% (Tiuria et al. 2001). Infeksi A. galli dapat menimbulkan lesio patologis seperti deskuamasi, hiperemi dan hemoragi (Balqis 2004), dan juga ulserasi intestinal yang kadang-kadang berakhir dengan kematian (Taiwo et al. 2002).

Tujuan Penelitian
Hipotesis
Manfaat Penelitian

TINJAUAN PUSTAKA
Cacing Ascaridia galli
Menurut Soulsby (1982) cacing Ascaridia galli mempunyai sinonim A. lineata dan A. perspiculum yang diklasifikasikan ke dalam kelas Nematoda, sub kelas Secernentea, ordo Ascaridia, superfamili Ascaridiodea, famili Ascarididae, dan genus Ascaridia. Cacing A. galli merupakan cacing terbesar dalam kelas nematoda pada unggas. Tampilan cacing dewasa adalah semitransparan, berukuran besar, dan berwarna putih kekuning-kuningan. A. galli memiliki kutikula ekstraseluler yang tebal untuk melindungi membran plasma hipodermal nematoda cacing dewasa (Bankov dan Barrett 1993). Pada bagian anterior terdapat sebuah mulut yang dilengkapi dengan tiga buah bibir, satu bibir terdapat pada dorsal dan dua lainnya pada lateroventral. Pada kedua sisi terdapat sayap yang sempit dan membentang sepanjang tubuh (Calneck 1997). Permin dan Hansen (1998) mengatakan bahwa cacing jantan dewasa berukuran panjang 51 ¡V 76 mm dan cacing betina dewasa 72 ¡V 116 mm. Cacing jantan memiliki preanal sucker dan dua spicula berukuran panjang 1 ¡V 2,4 mm, sedangkan cacing betina memiliki vulva dipertengahan tubuh. Telur A. galli berbentuk oval, berkerabang lembut, dan berukuran 73¡V92 x 45¡V57ƒÝm.

Enzim Protease Pada Eksretori/Sekretori Cacing
Peranan Sel Goblet Pada Kekebalan Terhadap Cacing
Peranan Sel Mast Pada Kekebalan Terhadap Cacing
Peranan Sel Eosinofil Pada Kekebalan Terhadap Cacing
Struktur Usus Halus Unggas

DISAIN PENELITIAN


PURIFIKASI PROTEASE DARI EKSKRETORI/SEKRETORI STADIUM L3 Ascaridia galli
Abstrak
Enzim proteolitik yang disekresikan oleh parasit memainkan peran pada proses penetrasi dan migrasi jaringan inang. Penelitian ini bertujuan untuk memurnikan protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli. L3 diperoleh dari usus halus 100 ekor ayam petelur HySex Brown tujuh hari setelah pemberian dosis 6000 L2 melalui oesofagus ayam. Sebanyak 5 ¡V 10 ekor L3 dikultur secara in vitro dalam setiap ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), pH 6,8, tanpa merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37oC dan 5% CO2 selama 3 hari. Ekskretori/sekretori dipreparasi dari produk metabolisme L3 yang dilepaskan ke dalam medium kultur. Protease dimurnikan dengan kromatografi filtrasi gel matriks sephadex G-100 dan anion exchange matriks DEAE sephadex A-50. Aktivitas protease diuji terhadap kasein. Konsentrasi protein dihitung mengikuti metode Bradford. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas enzim pada fraksi 31 kromatogram filtrasi gel lebih tinggi dibandingkan dengan anion exchange. Protease yang disekresikan oleh stadium L3 A. galli dapat dimurnikan berdasarkan berat molekulnya.

Abstract
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan

KARAKTERISASI PROTEASE DARI EKSKRETORI/SEKRETORI STADIUM L3 Ascaridia galli
Abstrak
Protease mengkatalis reaksi biologik, termasuk metabolisme protein dan reaksi imun. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakter protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli. L3 diperoleh dari usus halus 100 ekor ayam tujuh hari setelah pemberian dosis 6000 L2 melalui oesofagus ayam. Sebanyak 5 ¡V 10 ekor L3 dikultur secara in vitro dalam setiap ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), pH 6,8, tanpa merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37oC dan 5% CO2 selama 3 hari. Ekskretori/sekretori dipreparasi dari produk metabolisme L3 yang dilepaskan ke dalam medium kultur. Aktivitas protease diuji pada kasein 2%. Aktivitas protease dikaji terhadap sensitivitas inhibitor, temperatur, dan pH optimum. Konsentrasi protein dihitung mengikuti metode Bradford. Berat molekul protease diestimasi melalui sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE). Hasil penelitian menunjukkan bahwa L3 melepaskan protease yang dihambat oleh PMSF 0,5 mM. Temperatur dan pH optimum enzim berturut-turut 70oC dan 7. Aktivitas dan aktivitas spesifik enzim adalah 0,625 U/ml dan 4x10-3 U/mg. Estimasi berat molekul enzim pada 28 kDa. Hasil tersebut mencerminkan bahwa protease yang diekskresi/sekresikan oleh stadium L3 A. galli mengandung protease serin.

Abstract
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan

RESPONS PERTAHANAN MUKOSA USUS HALUS AYAM PETELUR YANG DIIMUNISASI DENGAN PROTEASE DAN DITANTANG DENGAN DOSIS L2 Ascaridia galli

Abstrak
Mekanisme pertahanan usus halus terhadap nematoda parasitik berhubungan erat dengan peningkatan jumlah sel eosinofil, sel goblet, dan sel mast mukosa. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui respons pertahanan mukosa usus halus berdasarkan jumlah sel goblet, sel mast, dan sel eosinofil pada duodenum, jejunum, dan ileum ayam petelur yang diimunisasi dengan protease serin dari ekskretori/sekretori L3 A. galli. Protease serin dimurnikan dengan teknik kromatografi filtrasi gel. Ayam diimunisasi dengan dosis 80 £gg (protease serin dengan aktivitas enzim 0,0098 U/ml pada crude dan 0,877 U/ml pada pure) yang dicampur dengan Fruend Adjuvant Complete. Imunisasi diulang tiga kali dengan dosis 60 £gg (dengan aktivitas enzim sebesar 0,0074 U/ml pada crude dan 0,657 U/ml pada pure) protease serin yang dicampur dengan Freund Adjuvant Incomplete dalam interval waktu satu minggu secara intra muskular. Satu minggu kemudian, ayam ditantang dengan dosis 1000 L2 A. galli, dan dinekropsi dua minggu pascatantang. Respons sel eosinofil, sel goblet dan sel mast mukosa diamati dan dihitung jumlahnya pada usus halus ayam petelur. Larva A. galli yang ditemukan di dalam usus halus dihitung jumlahnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa imunisasi dapat meningkatkan jumlah sel goblet, sel mast, dan sel eosinofil secara signifikan (P < 0,05). Imunisasi dapat menurunkan secara signifikan jumlah larva yang bertahan di dalam usus halus ayam petelur. Protease serin dapat memicu pertahanan mukosa terhadap penyakit parasitik yang disebabkan oleh A. galli.

Abstract
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan

GAMBARAN HISTOPATOLOGI USUS HALUS AYAM PETELUR YANG DIIMUNISASI DENGAN PROTEASE DAN DITANTANG DENGAN DOSIS 1000 L2 Ascaridia galli
Abstrak
Cacing nematoda Ascaridia galli menyebabkan perubahan patologi ketika larva berkembang di dalam epitel usus halus. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh protease serin yang disekresikan oleh L3 A. galli terhadap gambaran histopatologi usus halus berdasarkan lesio patologi, kerapatan villi, dan luas permukaan villi pada duodenum, jejunum, dan ileum ayam petelur. Protease serin dimurnikan dengan teknik kromatografi filtrasi gel. Ayam diimunisasi dengan dosis 80 £gg protease serin yang dicampur dengan Fruend Adjuvant Complete. Ayam diimunisasi dengan dosis 80 £gg (protease serin dengan aktivitas enzim 0,0098 U/ml pada crude dan 0,877 U/ml pada pure) yang dicampur dengan Fruend Adjuvant Complete. Imunisasi diulang tiga kali dengan dosis 60 £gg (dengan aktivitas enzim sebesar 0,0074 U/ml pada crude dan 0,657 U/ml pada pure) protease serin yang dicampur dengan Freund Adjuvant Incomplete dalam interval waktu satu minggu secara intra muskular. Satu minggu kemudian, ayam ditantang dengan dosis 1000 L2 A. galli, dan dinekropsi dua minggu pascatantang. Lesio patologi, kerapatan villi, dan luas permukaan villi dianalisis pada duodenum, jejunum, dan ileum usus halus ayam petelur. Hasil penelitian menunjukkan bahwa imunisasi dapat mencegah kerusakan usus halus secara signifikan. Protease serin melindungi villi usus dari ancaman infeksi A. galli.

Abstract
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan

PEMBAHASAN UMUM
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa stadium L3 A. galli mengekskresi/sekresikan protease. Sebelum aktivitas enzim diuji, terlebih dahulu dilakukan optimasi pada buffer Tris-HCl (pH 6 - 10), asam fosfat (pH 6 - 8), dan asam asetat (pH 5 - 10). Berdasarkan hasil optimasi buffer dan pH, diketahui bahwa buffer Tris-HCl pH 7 adalah buffer dan pH yang paling sesuai, sehingga untuk pengujian selanjutnya pada riset ini digunakan buffer Tris-HCl pH 7. Aktivitas protease dipertahankan pada antara pH 6,0 ¡V 8,0. Protease aktif pada pH (6,0 ¡V 10,0) (Gambar 1). Berdasarkan hasil yang diperoleh dari optimasi aktivitas enzim pada berbagai konsentrasi ammonium sulfat diketahui bahwa ammunium sulfat 40% adalah konsentrasi yang paling sesuai untuk pengendapan protein dari ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli (Gambar 2).

KESIMPULAN UMUM
Hasil purifikasi dengan kromatografi dapat diperoleh protease murni dengan berat molekul 28 kDa dari ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli.

Stadium L3 A. galli mengekskresi/sekresikan enzim proteolitik berkarakter serin protease.

Protease serin yang dilepaskan oleh L3 A. galli dapat memicu respons pertahanan mukosa yang ditandai dengan hiperplasia dan proliferasi sel goblet, sel mast mukosa dan sel eosinofi pada usus halus ayam petelur serta dapat mengurangi jumlah larva A. galli di dalam saluran cerna ayam petelur.

Protease serin yang dilepaskan oleh L3 A. galli dapat mengurangi lesio patologi usus halus ayam petelur, mempertahankan kerapatan villi dan luas permukaan villi usus halus ayam petelur dari infeksi A. galli.

SARAN
Dari hasil penelitian ini diketahui bahwa protease serin mempunyai potensi untuk diaplikasikan sebagai kandidat vaksin terhadap ascaridiosis sehingga disarankan agar dilakukan penelitian selanjutnya yang mengkaji kemungkinan protease serin untuk memicu respons humoral dan seluler ayam petelur.

DAFTAR PUSTAKA


LAMPIRAN