Ascaridiosis disebabkan oleh infeksi cacing nematoda parasitik Ascaridia galli. Penelitian telah dilakukan untuk mendapatkan antigen ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli sebagai pemicu pembentukan imunoglobulin Y (IgY) anti-ascaridiosis pada ayam petelur. Dosis 6000 L2 diberikan kepada 100 ekor ayam, dan tujuh hari kemudian larva yang sudah menetas (L3) diambil kembali dari dalam usus halus. L3 dikultur secara in vitro (5 - 10/ml) dalam rosswell park memorial institute (RPMI 1640), pH 6,8, tanpa merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37oC dan 5% CO2 selama 3 hari. Untuk mendapatkan antigen ekskretori/sekretori, medium kultur dipekatkan dengan vivaspin 30.000 MWCO, dan kuantitas protein antigen dihitung dengan metode Bradford. Berat molekul ekskretori/sekretori ditentukan dengan sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE).
Imunisasi aktif pertama pada ayam dengan dosis 80 μg diaplikasikan secara intramuskular. Imunisasi diulang tiga kali dengan dosis 60 μg dalam interval waktu satu minggu. Pada imunisasi pertama, antigen ekskretori/sekretori dicampur dalam fruend adjuvant complete dan imunisasi selanjutnya antigen dicampur dalam freund adjuvant incomplete. Telur ayam dikoleksi mulai hari ke-49 pascaimunisasi
Oleh:
DARMAWI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
COVER
HALAMAN PENGESAHAN
PRAKATA
RIWAYAT HIDUP
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Prevalensi nematodosis khususnya ascaridiosis yang disebabkan oleh infeksi Ascaridia galli pada ayam petelur masih sangat tinggi sehingga dapat menimbulkan kerugian ekonomi yang sangat berarti. Meskipun tidak menimbulkan kematian, namun ayam petelur yang menderita ascaridiosis dapat menyebabkan infeksi subklinis dan anoreksia (Permin et al. 2002) sehingga menimbulkan penurunan produksi yang sangat signifikan (Dahl et al. 2002).
Ascaridiosis pada ayam petelur dapat juga menimbulkan efek imunosupresi yang rentan terhadap infeksi bakteri patogen seperti Escherichia coli (Permin et al. 2002), Salmonella enterica (Chadfield et al. 2001), dan Pasteurella multocida (Dahl et al. 2002). Efek imunosupresi dilaporkan juga oleh Hørning et al. (2004) bahwa ayam yang telah terinfeksi cacing secara alami dan ayam yang telah diinfeksi oleh A. galli apabila divaksinasi dengan vaksin Newcastle disease De Soto dapat menurunkan titer antibodi terhadap virus tersebut. Untuk mengatasi kerugian yang ditimbulkan oleh ascaridiosis, maka infeksi A. galli pada ayam petelur harus dikendalikan.
Tujuan Penelitian
Hipotesis
Manfaat Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
1. Cacing Ascaridia galli
Cacing A. galli tersebar secara meluas pada negara-negara di suluruh dunia. Penyebaran ascaridiosis dapat terjadi pada keadaan temperatur tropis dan sub-tropis. Ascaridiosis pada ayam pertama dilaporkan terjadi di Jerman, selanjutnya terjadi di Brazil, India, Zanzibar, Pilipina, Belgia, China, Kanada, dan Inggeris. Selain pada ayam, A. galli juga ditemukan pada jenis unggas lainnya seperti angsa, kalkun, dan pada burung liar (Permin dan Hansen 1998).
2. Antigen Ekskretori/Sekretori Cacing Nematoda
3. Respons Kekebalan Unggas Terhadap Antigen
DISAIN PENELITIAN
KAJIAN PERKEMBANGAN L1, L2, DAN L3 Ascaridia galli PADA AYAM PETELUR
Abstrak
Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan perkembangan populasi L3 Ascaridia galli pada usus halus ayam petelur. Cacing A. galli betina dewasa diperoleh langsung dari lumen ayam kampung pada tempat pemotongan ayam komersial di Bogor. Telur cacing yang diperoleh dari uterus cacing betina A. galli dewasa diinkubasikan di dalam aquadestilata steril pada temperatur kamar selama 20 – 31 hari untuk mendapatkan telur infektif (L2) A. galli. Lima kelompok (A – E) dari 100 ekor ayam jenis Isa Brown diinfeksi dengan dosis 6000 L2 A. galli. Kelompok A dan B, ayam diberi enam kali berturut-turut dosis 1000 L2 dalam interval waktu masing-masing 30 dan 60 menit setiap pemberian. Kelompok C, ayam diberi tiga kali berturut-turut dosis 2000 L2 dalam interval waktu dua jam setiap pemberian. Kelompok D, ayam diberi dua kali berturut-turut dosis 3000 L2 dalam interval waktu tiga jam setiap pemberian. Kelompok E, ayam diberi satu kali dosis 6000 L2. L3 A. galli ditemukan di dalam lumen usus halus ayam setelah 10 hari pemberian L2. Hasil yang diperoleh adalah total 1.045.478 L1 dan 935.300 L2 yang dikoleksi dari 186 A. galli betina dewasa. Prosentase L1 berkembang menjadi L2 adalah 89,46% dan L2 berkembang menjadi L3 adalah 12.7%. Hanya pada kelompok E populasi L3 berkembang secara signifikan di dalam usus halus ayam. Hasil tersebut merefleksikan bahwa terjadi penurunan ketahanan terhadap ascaridiosis pada ayam yang diinfeksi dosis tinggi A. galli.
Abstract
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan
Saran
ISOLASI DAN KARAKTERISASI ANTIGEN EKSKRETORI/SEKRETORI STADIUM L3 Ascaridia galli
Abstrak
Penelitian telah dilakukan untuk menyiapkan antigen ekskretori/sekretori larva (L3) A. galli. L3 diperoleh dari usus halus 100 ekor ayam tujuh hari setelah pemberian dosis 6000 L2 melalui oesofagus ayam. Sebanyak 5 – 10 ekor L3 dikultur secara in vitro dalam setiap ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), pH 6,8, tanpa merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37oC dan 5% CO2 selama 3 hari. Medium ditambahkan 100 units ml-1 penicillin G, 100 μg ml-1 streptomycin, 5 μg ml-1 gentamycin, and 0.25 μg ml-1 kanamycin. Antigen ekskretori/sekretori dipreparasi dari produk metabolisme L3 yang dilepaskan ke dalam medium kultur. Untuk mendapatkan antigen ekskretori/sekretori, medium kultur dipekatkan dengan vivaspin 30.000 MWCO, dan kuantitas protein antigen dihitung dengan metode Bradford. Berat molekul antigen ekskretori/sekretori ditentukan dengan sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE). Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi protein antigen ekskretori/sekretori adalah 0,595 mg/ml dengan berat molekul 28 kDa. Ekskretori/sekretori L3 A. galli kemungkinan dapat dikembangkan sebagai antigen untuk memicu respons imun terhadap penyakit parasitik yang disebabkan oleh A. galli.
Abstract
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan
Saran
PURIFIKASI IMUNOGLOBULIN YOLK PADA KUNING TELUR DARI AYAM YANG DIIMUNISASI DENGAN ANTIGEN EKSKRETORI/SEKRETORI STADIUM L3 Ascaridia galli
Abstrak
Imunoglobulin pada unggas disebut immunoglobulin yolk (IgY), untuk membedakannya dengan IgG mamalia. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan IgY murni melalui purifikasi IgY kuning telur dari ayam yang diimunisasi dengan ekskretori/sekretori L3 A. galli. Imunisasi aktif pertama pada ayam dengan dosis 80 μg diaplikasikan secara intramuskular. Imunisasi diulang tiga kali dengan dosis 60 μg dalam interval waktu satu minggu. Pada imunisasi pertama, antigen ekskretori/sekretori dicampur dalam Fruend Adjuvant Complete dan imunisasi selanjutnya antigen dicampur dalam Freund Adjuvant Incomplete. Respons antibodi dideteksi dengan uji agar gel precipitation test (AGPT) dan enzyme linked immunosorbant assay (ELISA) setiap interval waktu satu minggu. Telur ayam dikoleksi mulai hari ke-49 pascaimunisasi. Anti-ascaridiosis IgY diekstraksi dari kuning telur dengan menggunakan ammonium sulphate dan dipurifikasi melalui fast performance liquid chromatography (FPLC). Kuantitas IgY murni ditentukan dengan metode Bradford (λ = 280 nm). Hasil menunjukkan bahwa antibodi di dalam kuning telur mulai terdeteksi dengan AGPT pada minggu keempat pascaimunisasi, dan respons imun yang diamati dengan ELISA mulai meningkat pada minggu kedua. Konsentrasi protein IgY setelah dipurifikasi adalah 0,875 ± 0.251 mg/ml. Produk yang dihasilkan oleh ekskretori/sekretori L3 A. galli dapat merangsang imunitas humoral melalui produksi IgY kuning telur.
Abstract
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan
Saran
PENGUKURAN ANTIBODI AYAM PETELUR YANG DIIMUNISASI DENGAN ANTIGEN EKSKRETORI/SEKRETORI STADIUM L3 Ascaridia galli MELALUI UJI ENZYME LINKED IMMUNOSORBANT ASSAY
Abstrak
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui respons antibodi di dalam serum ayam petelur terhadap ekskretori/sekretori stadium L3 Ascaridia galli. Sebanyak 12 ekor ayam dibagi dalam empat kelompok (A – D). Kelompok A adalah ayam yang tidak diimunisasi dan tidak diinfeksi. Kelompok B adalah ayam yang diimunisasi. Kelompok C adalah ayam yang diinfeksi. Kelompok D adalah ayam yang diimunisasi dan diinfeksi. Imunisasi dilakukan secara intramuskular dengan dosis 80 µg ekskretori/sekretori larva A. galli yang dicampur dengan Fruend Adjuvant Complete dan diulang tiga kali dengan dosis 60 µg yang dicampur dengan Freund Adjuvant Incomplete. Infeksi dilakukan langsung ke dalam oesofagus dengan dosis 1000 L2. Respons antibodi pada masing-masing kelompok dianalisis dengan uji enzyme linked immunosorbant assay (ELISA) setiap satu minggu selama 10 minggu pascainfeksi. Hasil menunjukkan bahwa imunisasi dan atau infeksi dapat memicu peningkatan titer antibodi serum secara signifikan (P < 0,05) selama 10 minggu pascainfeksi. Titer antibodi dari terendah sampai tertinggi ditemukan berturut-turut pada kelompok A, B, C, dan D. Titer tertinggi kelompok ayam yang diimunisasi adalah 2,63 ± 1,20 OD (optical density) dicapai pada minggu ketiga dan titer terendah adalah 1,51 ± 0,48 OD dicapai pada minggu kenol pascainfeksi. Antigen ekskretori/sekretori dapat memicu respons imunitas humoral terhadap penyakit parasit yang disebabkan oleh A. galli. Hasil tersebut merefleksikan bahwa produk ekskretori/sekretori larva A. galli mengandung antigen, dan antibodi berperan dalam mekanisme imunitas terhadap A. galli.
Abstract
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan
Saran
DETEKSI KEBERADAAN ANTIGEN Ascaridia galli DENGAN IMUNOGLOBULIN YOLK MELALUI METODE IMUNOHISTOKIMIA
Abstrak
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keberadaan antigen ekskretori/sekretori Ascaridia galli dengan metode imunohistokimia. Cacing A. galli dewasa dipotong secara melintang dan memanjang pada bagian kepala dan ekor. Jaringan tubuh A. galli yang dipotong diblok di dalam parafin dan preparat histologi dibuat melalui proses tahapan dehidrasi, clearing, infiltrasi dan embeding dengan parafin, pemotongan dan pewarnaan. Keberadaan antigen pada jaringan cacing A. galli dideteksi dengan uji imunohistokimia. Slide dihangatkan di dalam buffer sitrat pada temperatur 90-95oC. Aktivitas endogen dihambat dengan H2O2 3% dan skim milk 0,1%. Slide diinkubasikan dengan antibodi primer imunoglobulin yolk (IgY) selama satu malam pada temperatur 4oC, dan antibodi sekunder anti-chicken IgY HRP-conjugat selama satu jam pada temperatur ruangan. Slide diwarnai dengan kromogen AEC, conterstain dengan Lillie Mayer Haematoxylin, dan ditutup di dalam genangan gliserin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa antigen dapat dideteksi keberadaannya pada bagian kutikula dan saluran cerna A. galli. Hasil tersebut merefleksikan bahwa IgY yang terbentuk oleh rangsangan produk ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli dapat mengenal antigen A. galli sehingga IgY tersebut dapat digunakan dalam imunodiagnostik.
Abstract
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan
Saran
POTENSI ANTIGEN EKSKRETORI/SEKRETORI STADIUM L3, IMUNOGLOBULIN YOLK, DAN KOMBINASINYA TERHADAP PENURUNAN POPULASI Ascaridia galli
Abstrak
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui populasi larva di dalam usus halus ayam yang yang diimunisasi dan ditantang dengan cacing Ascaridia galli. Sebanyak 18 ekor ayam dibagi dalam enam kelompok (A – F). Kelompok A adalah sebagai kontrol, ayam pada kelompok B, C, dan D diimunisasi aktif secara intramuskular dengan dosis 80 µg ekskretori/sekretori larva A. galli yang dicampur dengan fruend adjuvant complete dan diulang tiga kali dengan dosis 60 µg yang dicampur dengan freund adjuvant incomplete. Ayam pada kelompok C, D, dan F diinfeksi dengan dosis 1000 L2. Ayam pada kelompok D dan E diimunisasi pasif secara oral setiap hari dengan 0,875 mg IgY anti-ascaridiosis. Populasi A. galli di dalam intestinal dihitung pada 12 minggu pascainfeksi. IgY anti-ascaridiosis diuji terhadap kelangsungan hidup A. galli setiap 12 jam secara in vitro. Hasil menunjukkan bahwa kombinasi imunisasi aktif dan pasif secara signifikan menurunkan kelangsungan hidup A. galli di dalam usus halus ayam petelur. Tindakan imunisasi berkorelasi positif dengan jumlah kelangsungan hidup cacing (worm burden) dalam saluran cerna ayam pada kelompok C dan D 12 minggu pascainfeksi. Hasil tersebut merefleksikan bahwa produk ekskretori/sekretori larva A. galli mengandung antigen, dan antibodi berperan terhadap dalam mekanisme imunitas terhadap A. galli.
Abstract
Pendahuluan
Metode Penelitian .
Hasil Penelitian
Pembahasan
Kesimpulan
Saran
PEMBAHASAN UMUM
Prosentase L1 yang berkembang menjadi L2 adalah 89,46% (Gambar 7) sedangkan prosentase L2 yang berkembang menjadi L3 adalah 12,7% (Tabel 1). Kemampuan L3 Ascaridia galli berkembang di dalam saluran cerna ayam Isa Brown dipengaruhi oleh besarnya dosis infeksi yang diberikan pada satu waktu. Semakin besar dosis L2 yang diberikan pada satu waktu semakin tinggi pula prosentase L3 yang berkembang. Prosentase perkembangan L3 yang paling tinggi ditemukan pada kelompok E, yaitu pada ayam yang diberikan satu kali dosis 6000 L2 sekaligus.
KESIMPULAN UMUM
Stadium L3 A. galli melepaskan ekskretori/sekretori dengan berat molekul 28 kDa.
Ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli berpotensi sebagai antigen pemicu pembentukan antibodi IgY di dalam kuning telur dan serum ayam petelur.
IgY kuning telur yang dipicu oleh antigen ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli berpotensi sebagai penghambat kelangsungan hidup A. galli.
SARAN
IgY yang telah berhasil dipurifikasi pada penelitian ini perlu diteliti karakternya, terutama ketahanannya terhadap temperatur dan pH yang sesuai karena aplikasi IgY untuk imunisasi pasif diberikan secara oral yang akan melewati traktus digestivus bagian atas sebelum mencapai situs predeleksi A. galli pada usus halus ayam.
Pada penelitian ini masih ditemukan cacing A. galli yang establish di dalam usus halus ayam petelur, meskipun ayam tersebut sudah diimunisasi secara aktif dan pasif. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian yang menitik-beratkan pada peranan imunitas seluler ayam petelur terhadap cacing A. galli.
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN 
