Metallothionein (MT) memiliki kemampuan untuk mengikat ion logam. Oleh karena itu, MT mempunyai peranan yang penting dalam mendetoksifikasi ion logam, termasuk aluminium (Al). Protein ini mempunyai berat molekul yang rendah dan mengandung banyak asam amino sistein. Penelitian ini tujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi fragmen cDNA dari gen yang menyandikan MT tipe 2 dari kedelai kultivar Slamet (GmMt2). Isolasi fragmen cDNA Mt2 Glycine max L. (GmMt2), diawali dengan isolasi RNA total. Dengan transkripsi balik, cDNA total berhasil disintesis dari RNA total sebagai cetakan. Dengan PCR, fragmen cDNA GmMt2 telah berhasil diisolasi dengan menggunakan cDNA total sebagai cetakan dan primer spesifik Mt2 yang dirancang dari Arabidopsis thaliana (AtMt2) (Acc. EM_PL:AY037263). Fragmen GmMt2 berhasil disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T Easy, kemudian plasmid rekombinan ini diintroduksikan ke dalam Escherichia coli DH5_.
Oleh
Yassier Anwar
SEKOLAH PASCASARJANA
IPB BOGOR
2008
HP 08984106289
ABSTRAK
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Metallothionein merupakan protein yang memiliki kemampuan mengikat dan mengkoordinasi atom-atom logam, mengandung banyak asam amino sistein, dan memiliki berat molekul yang rendah (4-8 kDa). MT telah ditemukan pada berbagai macam organisme termasuk tanaman, mamalia, cendawan dan beberapa spesies dari prokariot (Valle 1991; Cobbet & Goldsbrough 2002; Coyle et al. 2002).
Tujuan Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Struktur dan Klasifikasi Metallothionein
Metallothionein pertama kali ditemukan pada tahun 1957 sebagai protein yang
mengandung banyak sulfur dan mengikat cadmium (Cd) dari ginjal kuda (Vallee 1991), dan menunjukkan hubungan yang erat dengan beberapa ion logam lainnya seperti zink (Zn) dan cupper (Cu) (Kagi & Kojima 1987). Sejak itu, MT telah diidentifikasi hampir pada berbagai organisme yang berbeda termasuk tanaman, mamalia, fungi bahkan pada beberapa prokariot (Vallee 1991; Cobbett & Goldsbrough 2002; Coyle et al. 2002).
Metallothionein pada Tanaman
Metallothionein dan Detoksifikasi Logam
Peranan Metallothionein dalam Berbagai Mekanisme Seluler
Metallothionein pada Organisme Lain
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2007 sampai dengan bulan April 2008. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Seluler Tanaman, dan Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesian-The Netherlands), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB.
Bahan Penelitian
Metode Penelitian
Isolasi RNA total
Sintesis cDNA total
Isolasi putatif fragmen Mt2
Pengklonan fragmen putatif Mt2
Seleksi E. coli yang mengandung vektor rekombinan
Isolasi plasmid E. coli DH5á transforman rekombinan
Analisis cDNA sisipan
Pengurutan dan analisis sekuen fragmen GmMt2
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi RNA Total
RNA total dari ujung akar G. max kultivar Slamet telah berhasil diisolasi. Kuantifikasi RNA total dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa rendemen isolasi RNA total adalah 187 µg tiap g bahan tanaman. Jumlah ini menunjukkan rendemen isolasi RNA yang cukup tinggi dan optimal. Pengujian kemurnian RNA total dilakukan dengan membandingkan nilai OD260 dan OD280. Rasio OD260/OD280 dari RNA total pada penelitian ini adalah 1.88 (Tabel 2) yang menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi mempunyai kemurnian yang tinggi yang tidak terkontaminasi oleh protein (Farrel 1993).
Sintesis cDNA Total
Isolasi cDNA Mt2 melalui PCR
Pengklonan Fragmen GmMt2 ke dalam Plasmid pGEM®-T Easy
Analisis Fragmen GmMt2
Analisis Domain Fragmen GmMt2
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
cDNA utuh (246 pb) Mt2 dari G. max (GmMt2) telah berhasil diisolasi. GmMt2 ini mempunyai urutan nukleotida yang sama dengan AtMt2A dari A. thaliana. Motif urutan asam amino Cys dari GmMT2 terdiri dari Cys-Cys (residu 3-4), Cys-X-Cys (8-10, 14-16, 67-69, 73-75, 78-80) dan Cys-X-X-Cys (20-23). GmMT2 diduga memiliki peranan yang sama dengan AtMT2A yaitu mengikat dan mendetoksifikasi unsur logam dan membatasi kerusakan akibat oksidatif pada tanaman.
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
DAFTAR TABEL
1. Klasifikasi MT kedalam famili dan subfamili
2. Hasil Isolasi RNA Total
DAFTAR GAMBAR
1. Model struktur pengikatan logam oleh PsMTA
2. Vektor pengklonan pGEM® –T Easy
3. Tahapan isolasi, pengklonan dan karakterisasi fragmen GmMt2 dari kedelai kultivar Slamet.
4. RNA total dari ujung akar
5. cDNA aktin hasil PCR menggunakan cDNA total dari ujung akar sebagai cetakan
6. Fragmen GmMt2 hasil PCR menggunakan cDNA total dari ujung akar sebagai cetakan…
7. Seleksi biru putih koloni E.coli DH5á yang ditransformasi dengan DNA plasmid pGEM®–T Easy dan GmMt2 pada media seleksi yang mengandung ampisilin, IPTG dan X-gal
8. Hasil PCR terhadap koloni putih sebagai cetakan
9. Hasil pemotongan plasmid dengan enzim restriksi
10. Urutan basa fragmen GmMt2 dan deduksi asam aminonya
11. Posisi GmMt2 di dalam MCS dari pGEM®–T Easy
12. Urutan ORF dan motif asam amino Cys
13. Peta restriksi yang terdapat pada fragmen GmMt2
14. Filogenetik berdasarkan urutan nukleotida Mt2 dari berbagai spesies
15. Filogenetik berdasarkan urutan asam amino MT2 dari berbagai spesies
16. Posisi fragmen GmMT2 pada MT tanaman famili ke-15 berdasarkan analisis kesejajaran urutan asam amino
17. Profil domain yang terdapat pada fragmen GmMT2
DAFTAR LAMPIRAN
Hasil pengurutan nukleotida dengan primer T7
Hasil analisis penyejajaran fragmen GmMt2 dengan gen pada data GenBank menggunakan program BLAST
Hasil analisis penyejajaran urutan asam amino fragmen GmMT2 dengan protein pada data GenBank menggunakan program BLAST
